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    公开号:WO1989003997A1
    申请号:PCT/JP1988/001103
    申请日:1988-10-28
    公开日:1989-05-05
    发明作者:Kyoichi Inoue；Takafumi Ichida；Miki Miyagiwa；Taro Hayakawa；Shuji Kodama；Kazushi Iwata
    申请人:Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 肝 臓 癌 疾 患 の 診 断 法
    [0002] 〔技術分野〕
    [0003] 本発明 は コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を定量す る こ と に よ り 肝臓-癌疾患を診断す る 方法に 関す る も の であ る 。 さ ら に詳 し く は、 本発明 は ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー (テ ィ シ ュ . イ ン ヒ ビ タ ー ♦ ォ ブ ' メ タ 口 プ ロ テ ア ー ゼ ：
    [0004] T I MP ) に対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を 用 い る サ ン ド ィ ッ チ法に基づ く 酵素免疫学的測定法に よ る ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の測定法 を 手段 と し 、 肝臓癌疾患患者の 血清中、 血漿中 あ る い は関節液中 の コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー量がそ れぞれ健常人の血清中、 血漿中 あ る い は関 節液中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量に比べ て 明 ら かに 髙 ぃ値を 示す こ と に基づ い て肝臓癌疾患の診断 を行 う 方 法に 関す る も の であ る 。 な お、 上記の酵素免疫学的測定 法 と は、 固相抗体に結合 さ せ る 抗体お よ び酵素標識 を 付 与す る 抗体 と し て コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の異な る 抗 原決定基に対 し特異的 に 結合す る 2 種類の モ ノ ク 口 一 ナ ル抗体を 用 い る こ と を特徴 と す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の測定法を意味す る 。
    [0005] 〔背景技術〕
    [0006] コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー は、 ヒ 卜 お よ びそ の他の動 物の骨、 皮膚、 歯髄、 羊水、 血液、 関節液中 お よ び関節 軟骨細胞、 滑液細胞、 各種組織 由 来線維芽細胞、 線維肉 腫細胞培養液中 に存在する こ と が知 ら れて い る 。 コ ラ ゲ ナ ーゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量を測定す る 手段 と し て は、 従来、 そ の生物活性を測定す る こ と に よ る 方法が知 ら れて い る 。 し力 し、 J . Lab. Cl in. Med. 75, 258-263 〔 1973) に Eisenらカ 、 また、 . Arthritis and Rheumatism 27， 285 ~ 290 ( 1984) に Cawstonら が記載 して い る よ う に、 血清 中、 血漿中 あ る い は関節液中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一活性を測定す る に は、 それ ら の液中に、 そ の測定を妨 害す る 蛋 白質、 た と え ば、 な 2 —マ ク ロ グ ロ ブ リ ン が存 在す る ため、 従来知 ら れてい る 測定方法に よ っ て は、 そ の測定は不可能であ る 。 早川、 岩田 ら は、 先に、 ゥ シ コ ラ ゲナーゼ ィ ン ヒ ビ タ ーに対す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体を 用 い、 サ ン ド イ ッ チ法に基づ く 薛素免疫学的測定法（EIA) を行 う こ と に よ り 微量の試料で精度良 く 、 箇便かつ迅速 に コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を特異的 に定量す る 方法を 開発 し たが （特願昭 62— 42781号）、 本発明者 ら は、 ヒ ト 血清中、 血漿中 あ る い は関節液中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼィ ン ヒ ビ タ ー量が、 肝臓癌疾患に かかる こ と に よ り 明 ら かに増加する こ と を発見 し、 血清中、 血漿中 あ る い は 関節液中 に存在す る コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の量を上 記の酵素免疫学的測定法に よ り 測定す る こ と に よ っ て、 肝臓癌疾患の診断を行い得る こ と を見出 し た。
    [0007] 〔発明の開示〕
    [0008] 本発明 は、 上述の如 き 知見に基づいて な さ れた も の で あ っ て、 固相単体に結合さ せ る 抗体お よ び酵素標識を付 与す る 抗体 と し て ゥ シ コ ラ ゲナ 一 ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の異な る 抗原決定基に対 し 特異的 に 結合す る 2 種類の モ ノ ク 口 ー ナ ル抗体の組み合わせ を用 い て、 サ ン ド イ ッ チ法に よ り 酵素抗体免疫学的測定法 を 行 う こ と に よ り 、 血清中、 血漿中 あ る い は 関節液中 に存在す る ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を 定量 し 、 そ の定量値 を 健常人の示す値 と 比 較す る こ と に よ り 、 被測定者 肝臓癌疾患に かか っ て い る か否か を 診断す る 方法 を提供す る も の であ る 。
    [0009] 本発明者 ら は、 ゥ シ歯髄の培養外液か ら 精製 し た コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一を含む溶液 を Balb/cマ ウ ス の腹腔 内 に投与す る こ と に よ り 免疫 し た後、 そ の マ ウ ス の ひ臓 細胞 を 分離 し た 。 そ の ひ臓細胞 と 8 — ァ ザ グァ ニ ン耐性 ミ エ ロ ー マ細胞 NS-1と を 5 ： 1 の割合で混合 し、 50%ボ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル 4000中で融合 さ せ る こ と に よ り ハ イ ブ リ ド ー マ を得た。 ポ リ ス チ レ ン 製 96穴マ イ ク ロ ゥ ェ ル に 各 ゥ エ ル 当 た り 6.0 X 105個 と な る よ う に 得 ら れ た ハ イ ブ リ ド ー マ を分散 し た後、 HA T培地中で培養 し た 。 各 ゥ エル の培養液中 に ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー に対す る 抗体が産生 さ れて い る か否か を 固相一抗体結合 テ ス ト 法（EL ISA) に よ り チ ェ ッ ク し 、 そ れが陽性で あ る ゥ エル中の ハ イ プ リ ド ー マ を 限界希釈法 に よ り ク ロ ー 二 ン グ し た 。 そ の結果、 ゥ シ歯髄 コ ラ ゲ ナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一 に対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を 産生す る 17種類の モ ノ ク ロ ー ン を 得、 そ の各モ ノ ク ロ 一 ン を Baib/cマ ウ ス の腹 腔内 に 投与す る こ と に よ り 、 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を 含む 腹水を得た。 そ の腹水か ら硫酸ア ン モ ニ ゥ ム に よ る 塩析 分別、 DEAE- Sephace 1に よ る イ オ ン交換ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ーおよび Sephac ry 1 S-300 S u p e r f i n eに よるゲルろ過 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー な どに よ っ てモ ノ ク ロ ーナル抗体を 精製 し た。 上記の如 く 精製 し た 17種類の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗体い ずれ も ゥ シ コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー と 特異的に 交叉 し たが、 それ ら の なかの 4 種類の モ ノ ク ロ ーナル抗 体、 すな わ ち 、 IgG (ク ロ ー ン 7-6C1) 、 IgG ( ク ロ ー ン 7- 19F6)、 IgG ( ク ロ ー ン 7-21BI2) お よ び I gG ( ク ロ ー ン 7- 23G9) 力 s ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー と も 反応す る こ と を ゥ エ ス タ ン ブロ ッ テ ィ ン グに よ っ て明 ら 力 に した。 こ れ ら 4 種類のモ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の う ち 2 種類のモ ノ ク ロ ー ナ ル抗体、 すなわ ち、 IgG (ク ロ ー ン 7- 23G9) を 固 相用抗体 と し、 IgG ( ク ロ ー ン 7-6C1) か ら調製 し た Fab' (ク ロ ー ン 7-6C1) — POD複合体 を標識抗体 と し て用 いた サ ン ド ィ ツ チ法に基づ く E I Aを行 う こ と に よ り 、 ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼイ ン ヒ ビ タ ー を微量（1.5P3) で、 特異的に、 精度良 く 、 定量する こ と がで き た。 こ のサ ン ド イ ッ チ法 を 用 いて、 健常人血清 50検体中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を定量 した と こ ろ、 血清 l m£当た り 184 ± 30ngの コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ーが存在す る こ と がわ力 つ た。 一 方、 原発性肝臓癌患者血清 100検体中 お よ び転移性肝臓 癌患者血清 3 検体中 に存在す る コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビ タ 一量は血清 1 mi2当た り それぞれ平均 486 ± 316ngお よ び 1172 ± 712ngであ り 、 こ れ ら の値は健常人血清中に存在 す る そ の値に比べて 明 ら かに高い 。 一方、 肝硬変患者血 清 46挨体、 慢性活動性肝炎患者血清 45検体お よ び慢性非 活動性肝炎患者血清 26検体の 中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一量は血清 1 mj2当 た り そ れぞれ平均 228 ± 163 ng、 233 ± 88nsお よ び 166士 73nsであ り 、 健常人血清中 に 存在す る そ の量 と 比べて有意の差は認め ら れ な か っ た 。 従 っ て、 種 々 の肝臓病患者中 で も 肝臓癌患者に お け る 血 清中での特異的 に高い コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の量に 着 目 し て、 患者血清中 の コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー量 を 測定す る こ と に よ り 、 そ の患者が、 肝臓癌患者であ る か 否かを診断す る こ と がで き る こ と に な る こ と が判 っ た。 ま た、 健常人血漿 26検体中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の量は血漿 1 m£当た り 64 ± 10i ^であ る の に対 し 、 原発性 肝臓癌患者 8 検体中 に存在す る ユラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一量 は血漿 1 当 た り 583 ± 447ngであ り 、 建常人血漿中 に存在す る そ の値に比べ て 明 ら かに高 い こ と が認め ら れ た 。
    [0010] た だ し、 血清中 あ る い は血漿中 に 存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー量増加の現象 は、 肝臓癌患者以外に 慢性 関節 リ ウ マ チ疾患患者に つ い て も 認め ら れ る の で、 こ の 血清中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の測定 を 、 肝機能判 定法であ る ZTT (硫酸亜鉛混濁反応） 、 GOT ( グル タ ミ ン オ ギザ 口 酢酸 ト ラ ン ス ア ミ ナ ー ゼ）、 GPT ( ダル タ ミ ン ピ ル ビ ン 酸 ト ラ ン ス ァ ミ ナ ー ゼ ）、 ALP ( ア ル 力 リ 性 フ ォ ス フ ァ タ 一ゼ）、 LDH (乳酸脱水素酵素）、 ァ — GPT ( ァ — グ ル タ ミ ル ト ラ ン ス ぺ プチ ダー ゼ） 、 PH ( プ ロ リ リレノヽ ィ ド ロ キ シ ラ ーゼ） お よ び AFP ( tr — フ エ ト プ ロ テ イ ン） な ど の測定 と 併用 す る こ と に よ り 、 被測定者の肝臓癌の罹息 の有無を診断す る こ と がで き る の であ る 。
    [0011] 本発明方法におい て は上記の酵素免疫学的測定法が用 い ら れ る が、 固相単体 と し て抗原や抗体を受動的に 良 く 吸着す る ポ リ ス チ レ ン製、 ポ リ カ ー ボネ イ ト 製、 ポ リ プ ロ ピ レ ン製、 あ る い はボ リ ビニ ー ル製の ボー ル 、 マ イ ク 口 プ レ ー ト 、 ス テ ィ ッ ク 、 試験管な どの種 々 の材料お よ び使用形態が任意に選択、 使用 で き る 。 一方、 酵素標識 を 付 す る 抗体 と し て は 、 抗体含有物 を 硫安分画後、
    [0012] DEAE - Sephac e lの如 き 陰ィ オ ン交換ゲル に よ り 精製 し た
    [0013] I g G画分、 さ ら に はペ プ シ ン 消化後、 還元 し て得 られる 特異的結合部分 Fab 'を用 い る こ と も で き る 。
    [0014] 前述の と お り 、 本発明方法は、 固栢単体に結合 さ せ る 抗体お よ び酵素標識を付与す る 抗体 と し て、 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビタ ー の異な る 抗原決定基に対 し、 特異的に結 合す る 2 種類の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の組み合わ せ を用 い た固相抗体酵素免疫学的測定法に基づいた ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の定量を行い、 そ の結果を 、 健常人の 値 と 比較する こ と に よ っ て、 被測定者が、 肝臓癌疾患に 力、力 つ て レ、 る か否力 を 診断す る も の であ る 。
    [0015] 以下実施例に よ り 本発明 を具体的に説明す る 。 ただ し 本癸明 は こ れ ら に限定 さ れる も の では な い。
    [0016] 実施例 1 抗 ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の 作製
    [0017] (a) 抗原 一 ゥ シ コ ラ ゲナ 一 ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の調製
    [0018] J . Biochera. 96, 395〜 404 ( 1984)に記載の本癸明者 ら の方法に従い ゥ シ未萌出知歯の根部歯髓 を イ ー グル MEM 培地 （ 日 水製薬製） で培養 し た培養外液か ら Con A - セ フ ァ ロ ー ス 、 ウ ル ト ロ ゲル AcA 44お よ び DE— 52セ ル ロ ー ス の各カ ラ ム を用 い て コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を 精製 し た 。 精製 イ ン ヒ ビ タ ー は J . ol . Biol . 8 , 579~ 599 ( 1973) に記載の Laemml iら の方法に従い ド デ シル硫酸ナ ト リ ウ ム — ポ リ ア ク リ ルア ミ ド ゲル電気泳動（SDS-PAGE) で調べた と こ ろ 分子量約 32， 000ダル ト ン （ D )の単一バ ン ド を示 し た。
    [0019] (b) 抗体産生細胞の調製
    [0020] 6 週令の Balb/c雌マ ウ ス 2 匹 を ま ず フ ロ イ ン ド完全ァ ジ ュ バ ン ド 中で、 前記（ a )で記述 し た精製 ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー で初回免疫す る 。 マ ウ ス に そ れぞれ 48zgの ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を 0.4rai2の溶液 と し て腹腔内投与す る 。 さ ら に 30日 目 に 生理食塩水に溶解 し た の ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を追加免疫す る ， 最終免疫 と し て 58日 目 に 腹腔内投与 C95/is/ 500 生理食 塩水） に よ り 補助免疫 し 、 3 日 後 に マ ウ ス 脾臓 を取 り 出 し 、 脾細胞 を 調製す る 。
    [0021] ( c ) 細胞融合
    [0022] (1) 以下の材料お よ び方法 を 用 い る 。 RPMI 1640培地 ： RPMI No. 1640(Dif co Labo-rator i es) に重炭酸ナ ト リ ウ ム （ 12raM)、 ピ ル ビ ン酸ナ ト リ ゥ ム （ 1 mM)、 L — グル タ ミ ン （ 2 mM：)、 ペ ニ シ リ ン G カ リ ウ ム （50 ϋΖ mH)、 硫酸 ス ト レ プ ト マ イ シ ン （ Μ ) 、 お よ び 硫酸ア ミ カ シ ン （100/^/ mQ) を 加 え 、 ド ラ イ ア イ ス で pH を 7 - 2に し、 0. 東洋 メ ン ブ レ ン フ ィ ル タ ー で除菌 ^過 す る 。
    [0023] NS- 1 培地 ： 上記 RPMI 1640培地に除菌^過 し た仔牛胎 児血清 CM- A. Bioproducts) を 15 % (： v/ v)の濃度にカロえ る 。
    [0024] PEG 4, 000溶液 ： RPMI 1640培地の ポ リ エ チ レ ン グ リ コ - )V 4,000 ( PEG 4,000、 Merck & CO. , Inc.) 50% ( / w) 無血清溶液を調製す る 。
    [0025] 8 - ァ ザグァ ニ ン耐性 ミ エ ロ ー マ細胞 NS- KP3-NS1-1) との融合は Selected Method in Cel lular Immunology Ced. B. B . ishel 1 and S.M. Shi i gi W. H . Freeman and Company (1980)、 351〜 372に記載の 0 i らの方法を若 干改変 し て行 っ た。
    [0026] (2) 前記 ）で調製 し た有核脾臓細胞 （生細胞率 100% ) と ミ エ ロ ー マ細胞（生細胞率 100% ) と を 5 ： 1 の割合で 融合す る 。 脾臓細胞 と ミ エ ロ ー マ 細胞 と を 別 に 前記の RPM I 1640培地で洗浄する 。 次に 同 じ培地に けん濁 し、 融合 さ せ る た め上記の割合で混合す る 。 容量 50mfiの円錐 形 ス チ ロ ー ル樹脂製試験管（lwaki Glass) を用 い、 40m2 の RPM I 1640培地中 400 x g、 10分間遠心し、 上清を完全 に吸出す る 。 沈澱細胞に 37°C加温 PEG 4,000溶液 1.3mi2を 穏やかに 撹拌 し なが ら 1 分間で滴下 し、 さ ら に 1 分間撹 拌 し細胞 を再けん濁、 分散 さ せ る 。 次に 37 °C加温 RPM I 1640培地 1.3rai2を 1 分間で滴下す る 。 こ の操作を さ ら に 1 回繰返 し た後、 同培地 9 を 2 〜 3 分間で常に撹拌 し な が ら滴下 し細胞を分散 さ せ る 。 こ れ を 400 X 2、 10分間 '遠心分離 し、 上清を 完全に吸引除去す る 。 次に こ の沈澱 細胞に 37°C加温 NS-1培地 12.9rai2を す みやかに 加え 、 細胞 の大 き い塊 り を 10m2の ピぺ ッ ト を 用 い て注意深 く ピぺ ッ テ ィ ン グ し て分散す る 。 さ ら に 同培地 26rai2を 加え て希釈 し 、 ポ リ ス チ レ ン 製 96穴 マ イ ク ロ ウ ェ ル （ I waki Glass) に ゥ エ ル当 り 6.0 X 105個 / 0. i mJ2の細胞 を 加え る 。 な お、 こ の時使用 す る 96穴マ イ ク 口 ゥ エ ル は前処理 と し て 0.2 mfiの NS-1培地 を 加え、 炭酸 ガ ス 培養器中（37°C )で一晚保 温 し、 使用時に培地 を吸引除去 し て お く 。 細胞 を 加 え た 上記の マ イ ク ロ ウ ェ ル を 7 % 炭酸 ガ ス ノ 93%空気中で温 度 37°C、 湿度 100%下に培養に 付す る 。
    [0027] (d) 選択培地に よ る ハ イ プ リ ド ー マ の選択的増殖
    [0028] ( 1 ).使用 す る 培地は以下の と お り であ る 。
    [0029] HAT培地 ： 前記（c)で述べ た NS-1培地に さ ら に ヒ ポ キ サ ン チ ン （ΙΟΟ Μ：)、 ア ミ ノ ブ テ リ ン （0.4 iM)、 お よ びチ ミ ジ ン （16/iM)を 加え る 。
    [0030] HT培地 ： ァ .ミ ノ プテ リ ン を除去 し た以外 は上記 HAT培 地 と 同一組成の も の であ る 。
    [0031] (2) 前記（c)の培養開始後翌 日 （ 1 日 目 ）、 細胞 に パ ス ッ 一ル ビぺ ッ ト で HAT培地 2 滴 （約 0. Imi2) を加え る 。 2 、 3 、 5 、 8 、 11日 目 に培地の半分（0. Imi2)を新 しい HAT培 地で置 き換え、 14 日 目 に培地の半分 を新 し い HT培地で 置 き換え る 。 以降 3 4 日 毎に培地の半分を新 し い HT培 地で置 き 換え る 。 通常 2 〜 3 週間で充分 なハ イ プ リ ドー マ の生育が観察され る 。 ハ イ ブ リ ド ー マ生育全 ゥ エ ル に つ い て次項（e)記載の固相 -抗体結合テ ス ト 法 （ELISA) に よ り 陽性 ゥ エ ル を チ ェ ッ ク する 。 次に フ ィ ー ダ一 と し て 107個のマ ウ ス胸腺細胞を含む HT培地 1 mfiを ポ リ ス チ レ ン製 24穴セ ル ゥ エ ル（Iwaki Glass) に加え た も の を用 い、 上記で検出 さ れた各陽性ハ イ プ リ ド ーマ の全内容物 を移す。 こ れ を前記（ c ) に お け る と 同様に 7 %炭酸ガ ス 存在下、 37°Cで約 1 週間培養に付す る 。 そ の間 i 〜 2 回 各 ゥ エルの上清 0.5mfiを新 し い HT培地 0.5m2と 交換する 。 ノヽ ィ プ リ ドー マ の充分生育 し た時点で EL I SA法に よ り 陽 性を再確認 し、 それぞれに つ い て次項（ f )記載の限界希 釈法に よ る ク ロ ー ニ ン グを行 う 。 な お、 ク ロ 一 ニ ン グに 使用後の残液を ポ リ ス チ レ ン製 25 cm 2組織培養フ ラ ス コ CI waki Glass)に移 し 、 凍結保存用試料を調製す る 。
    [0032] (e) 固栢 — 抗体結合テ ス 卜 （ELISA) に よ る 抗 ゥ シ コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー 抗体産生ハ イ ブ リ ド ー マ の 検
    [0033] Anal . B i ochem . 104. 205〜 214 ( 1980 ) に記載の Rennar d ら の方法を若干改変 した方法を用 い る 。 こ の方 法は、 ハ イ プ リ ドーマ抗体の検出 に適 し て い る 。 96穴 ミ ク ロ タ イ ト レ ー シ ヨ ン プ レ ー ト (F l ow Labora tor i es , Inc.) を 0.5〜： の ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一 で コ ー ト し、 次 に 、 未 コ ー ト 部分 を 1 %牛血清ア ル ブ ミ ン (BSA)で ブ ロ ッ ク す る 。 こ れ に 前記（d)で得 ら れた ハ イ ブ リ ド ー マ生育 ゥ エ ル の上清の一部 を 加え て室温で約 1 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト す る 。 2 次抗体 と し て西洋わ さ びペ ル ォ キ シ ダー ゼ標識ャ ギ抗マ ウ ス ィ ム ノ グ ロ プ リ ン （capp- el Lab .)を 加え、 さ ら に 室温で約 1 時間 ィ ン キ ュ ベ ー 卜 す る 。 次に過酸化水素 と 基質で あ る o — フ エ 二 レ ン ジ ァ ミ ン を 加え生成 し た褐色の程度を 肉 眼で定性的 に判定す る か、 あ る い は コ ロ ナ 2 波長 マ イ ク ロ プ レ ー ト 光度計 (MTP-22、 コ ロ ナ電気社） を 用 レ、 て 500nmの吸光度を 測定 す る 。
    [0034] (f ) ク ロ ー ニ ン グ
    [0035] 前記（ d ) の操作後、 各 ゥ エ ル中 に は 2 種以上の ハ イ ブ リ ド ー マが生育 し て い る 可能性が あ る の で、 限界希釈法 に よ り ク ロ ー ニ ン グ を 行い、 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体産生ハ イ ブ リ ド ー マ を取得す る 。 NS - 1培地 m2当 り フ ィ ー ダ一 と し て 1 0 7 個の マ ウ ス 胸腺細胞を 含む ク ロ ー ニ ン グ培地 を 調製 し 、 96穴マ イ ク ロ ウ ェル の 36ゥ エル、 36ゥ エル お よ び 24 ゥ エ ル に ゥ エ ル当 り 5 個、 1 個お よ び 0 . 5個の ハ イ プ リ ド ー マ を 力 Bえ る 。 5 日 目 、 12日 目 に 全 ゥ エ ル に 各約 O . l rafiの NS - 1培地を追加する 。 ク 口 一 二 ン グ開始後 14〜 15日 で充分 な ハ イ プ リ ド ー マ の生育が認め ら れ、 コ ロ ニ 一形成陰性 ゥ エルが 50 %以上であ る 群について EL I SA法 を行 う 。 テ ス ト し た全ゥ エルが陽性でな い場合、 抗体陽 性 ゥ エ ル中 の コ ロ ニ ー数を確認 し、 ゥ エル中に i コ ロ ニ 一が確認さ れた ゥ エ ルを 4 ~ 6 個選び再ク ロ ー ニ ン グす る 。 最終的に ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー に対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体産生ハイ プ リ ド ー マ 17株が得 ら れた。
    [0036] (g) モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の 生体外増殖お よ び生体内増 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の増殖は常法に よ る 。 すなわ ち 、 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体は 、 得 ら れた各ハ イ ブ リ ド ー マ を NS -1培地な どの適当 な培養液で培養 （生体外増殖） し、 そ の培養上清か ら得る こ と がで き る （モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 た ん白質濃度は 10〜； ΙΟΟ/^Ζ ηιβであ る ）。 一方、 大量に抗 体を得る た め に は脾細胞 と ミ エ ロ ー マ細胞の 由来動物 と 同系の動物（Balb/c、 マ ウ ス ）に腫瘍形成促進剤 プ リ ス タ ン （2， 6 ， 10， 14ー テ ト ラ メ チルペ ン タ デカ ン、 A i dr i ch Chemical社） を マ ウ ス 一匹当 た り 0.5mfi腹腔内投与 し 、 1 〜 3 週間後に、 各ハイ プ リ ド ー マ 1 X 107個 を 同 じ く 腹 腔内投与す る こ と に よ り 生体内 で、 さ ら に、 i 〜 2 週間 後、 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体たん 白質濃度 4 〜 7 sZ m£の腹 水を得る こ と がで き る 。
    [0037] (h) モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 の 重鎮、 軽鎖及びア イ ソ タ ィ プ
    [0038] 前記（ g )で得 ら れた各 々 の腹水を先ず ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー を コ ー ト し た ミ ク ロ タ イ ト レ ー シ ヨ ン ブ レ ー ト に前述 し た ELISA法に従 っ て結合 さ せ る 。 PBSに よ る 洗浄後次に、 ア イ ソ タ イ プ特異的 ゥ サ ギ抗マ ウ ス Ig抗 体（ZyraedLaborator ies)を 力 (3え る 。 PBSに よ る 洗浄後、 西 洋わ さ びペル ォ キ シ ダー ゼ標識ャ ギ抗 ゥ サ ギ I gG( H + L ) 抗体を 加え、 基質 と し て 2， 2'— ア ジ ノ ー ジ （ 3 — ェ チ ル ベ ン ゾチ ア ゾ リ ン 硫酸 一 6 ) お よ び過酸化水素を 用 い て 検出 し た。 そ の結果 を ま と め て後掲の第 1 表に示 し た 。 得 ら れた ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー に対す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体の 内 15個が免疫 グ ロ プ リ ン鎮 ァ 1ノ /c を 、 1 個；^ ァ 2 a Z /c を 、 そ して、 1 個； ^ 7 2 b ノ c を有 し て い た 。
    [0039] (i) モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の精製
    [0040] 前記（g)で得 ら れた各腹水 を 硫安分画（40%飽和） 後、 塩化ナ ト リ ゥ ム 0.06 Mを含む 40mM リ ン酸緩衝液、 PH8.0 で平衡ィ匕 し た DEAE-Sephacel (pharmac ia¾ )の ^ 吸着画分 を分取 し、 こ の I g G画分 を更に 0 . 42 M塩化ナ ト リ ウ ム を 含む 50mM リ ン酸緩衝液、 PH7.4で平衡ィヒ し た Sephac ry l S - 300Super f ine ( Pharmacia社） 力 ラ ム でゲノレ炉過 し 、 培地中 の FCSお よ びマ ウ ス 由 来の たん 白質 を 分離、 除去 し た 。
    [0041] 実施例 2
    [0042] ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー と モ ノ ク ロ ー ナ ル抗 体 と の交叉性
    [0043] (a) 酵素標識モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 （ Fab POD複合体） の 調製法
    [0044] (1) Fab'画分の調製 実施例 1 ( i )で得 られた I gG画分を O . i M塩化ナ ト リ ゥ ム含有 0.1M酢酸緩衝液 （PH4.2) に溶解 し、 そ の溶液 を 以下述べ る よ う に し てペ プ シ ン で消化 し た。 すな わ ち 、 前記画分中の IgGに対 し て 2 % (w/w)のペ プ シ ン を加え、 37°C、 24時間消化 した。 更に そ の消化物に 2 M ト リ ス溶 液を 加えて pHを 7. 0に調整す る こ と に よ り 消化反応を停 止 さ せ、 0.1 M リ ン酸緩衝液（pH7.0)で平衡化 し た ウ ル ト π ゲル icA 44カ ラ ム （ LKB製） を用 い たゲル - 過に よ り FCab' 画分を 分取 し た。
    [0045] 次に 、 こ の F ( a b ' ) 2 画分を エ チ レ ン ジァ ミ ン 四酢酸
    [0046] (EDTA)含有 0.1M リ ン酸緩衝液（PH6.0)中で透析 し、 終濃 度 10mMと な る よ う にア ミ ノ エ タ ン チオー ル （MEA)を加え 37 °Gで 1.5時間還元 した後、 5 mM EDTA含有 0.1 M リ ン酸 緩衝液（PH6.0) で平衡化 し た ウ ル ト 口 ゲル AcA 44カ ラ ム を用 いてゲル炉過 し、 Fab'画分を分取 し た。
    [0047] C2) マ レ イ ミ ド標識 POD画分の調製
    [0048] 上記（ 1 )の操作 と は別に、 以下述べる よ う に し て西洋 わ さ び由来ペ ルォ キ シ ダーゼ（POD)にマ レ イ ミ ドを標識 し た。 すなわ ち、 PODを lOmgZmfiの量で 0.1M リ ン酸緩衝 液（PH7.0)に溶解 し、 そ の PODに対 して、 25倍モ ル量の N — ( ε — マ レ イ ミ ド カ ブ 口 イ レ オ キ シ ） コ ノヽ ク 酸 イ ミ ド (E CS)を ジ メ チ ル ホ ル ム ア ミ ド溶液 と し て加え、 30°C、 30分間反応 さ せた。 こ れ を 0.1M リ ン酸緩衝液（PH6.0)で 平衡化 し た セ フ ア デ ッ ク ス G — 50カ ラ ム でゲル ^過 し 、 マ レ イ ミ ド標識 POD画分 を 分取 し た。 (3) Fab' -POD複合体画分の調製
    [0049] 上記（ 1 )の如 く し て調製 し た画分中の Fab ' に対 して上 記（2)で得 ら れ た 画分中 の マ レ イ ミ ド標識 PODと し て等モ ル に な る よ う に し て、 両画分 を 混合 し、 更に Fab 'お よ び マ レ イ ミ ド標識 PODの終濃度が 100/iMと な る よ う に 5 mM EDTA含有 0 · i M リ ン 酸緩衝液（PH6.0)で希釈 し た。 こ の混 合液を 4 °C、 20時間反応後、 Fab'の 10倍モ ル量の N — ェ チ ル マ レ イ ミ ド で未反応の チ オ ー ル基 を ブ ロ ッ ク し た 。 こ れ を 0.1 M リ ン酸緩衝液 （ PH6.5) で平衡化 し た ウ ル ト 口 ゲル AcA 44カ ラ ム でゲル炉過 し 、 Fab' -POD複合体画分 を 分取後、 0.1%牛血清ア ル ブ ミ ン （BSA) 及び 0.005 % チ メ ロ サ ール を 添加 し 、 4 °C で保存 し た。
    [0050] (b) ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ
    [0051] 実施例 1 ( a )項で精製 し た ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビタ ー を SDS- PAGEに供 した後、 市販の POD標識ャ ギ抗 マ ウ ス 免疫 グ ロ ブ リ ン お よ び上記実施例 2 ( a )で得 ら れ た Fab' -POD複合体 を 用 い て細胞工学 1 & 2 、 1061- 1068 (1983)に 記載の 田部の方法に従 つ て ゥ ェ ス タ ン プ ロ ッ テ イ ン グ を 行い 、 酵素抗体染色のパ タ ー ン を 得た 。 こ れ を 第 1 図 に 示す 。 第 1 図 に お い て、 A及び B は ウ ェ ス タ ン プ ロ ッ テ ィ ン グ後の 二 卜 ロ セ ル ロ ー ス膜 を そ れぞれ実施 例 2 (a)で得 ら れた Fab' (ク 口 ー ン 7— 3F1)— POD複合体及 び Fab' (ク ロ ー ン 7— 21B12) ― POD複合体で免疫染色 し た 結果を示す も の であ る 。
    [0052] ま た、 1 ~ 16は下記の各モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 （ い ずれ も I g G タ イ プ） の 溶液 に ゥ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ後 の ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 腠を 浸 し た 後、 あ ら た め て各 ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜を P O D標識ャ ギ抗マ ウ ス 免疫 グ ロ プ リ ン CCappel Laborator ies製） で免疫染色 し た結果を示す も の であ る 。
    [0053] I ： ク ロ ー ン 7— 3 1、 2 ： ク ロ ー ン 7 - 4F2、 3：ク ロ ー ン 7 - 5A 4 : ク ロ ー ン 7— 6C1、 5 ： ク ロ ー ン 7— 7F11、 6 : ク ロ ー ン 7— 8B2、 7 : ク ロ ー ン 7— 9B4、 8 : ク ロ ー ン 7— 10E1K 9 ： ク ロ ー ン 7— 11A5、 10 ： ク ロ 一 ン 7— 12B6、 11 ： ク ロ ー ン 7— 15E8、 12 : ク ロ ー ン 7— 18F3、 13 : ク ロ ー ン 7 — I 9F6、 14 : ク ロ ー ン 7— 20C2、 15 : ク ロ ー ン 7— 21B12、 16 ： ク ロ ー ン 7— 23G9。
    [0054] 第 1 HIに示さ れ る と こ ろ 力 ら 明 ら 力 な よ う に、 上記 の モ ノ ク 口 ー ナ ル抗体は 、 いずれ も ゥ シ歯髄 コ ラ ゲ ナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー と 交叉す る こ と がわ力 つ た。
    [0055] 実施例 3
    [0056] サ ン ド ィ ツ チ酵素免疫測定法
    [0057] (a) モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体結合ボー ル の調製法
    [0058] J . Immunoassay 4, 209 ~ 327( 1983)に記載の石川 ら の 方法に従 っ て実施例 1 ( i )で得 ら れた モ ノ ク ロ 一 ナル抗 体を 0.1 % ア ジ化ナ ト リ ゥ ム 含有 0.1 M リ ン 酸緩衝液 （ PH 7.5) に溶解 し、 それを 100 i3Z mi2 (A28。 = 0.15) の濃度 に調整 し た後、 そ の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体溶液に ポ リ ス チ レ ン ボ ー ル（径 6.5mm、- Prec is ion Plastic Bal l製） を 浸 漬 し、 4 °Gに 24時間静置 し た 。 次に モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 溶液を除去 し た後、 0. 1 % BSA、 0. 1 %塩化ナ ト リ ウ ム及 び 0.1 % ア ジ化ナ ト リ ゥ ム含有 10mMリ ン 酸緩衝液（pH7.0)
    [0059] (以下緩衝液 A と 略記す る ） で 5 回洗浄 し た後、 緩衝液
    [0060] A に 浸 し、 4 。Cで保存 し た 。
    [0061] ■ (b) サ ン ド イ ッ チ測定法
    [0062] 精製 し た コ ラ ゲナ 一 ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー溶液、 あ る レ、 は コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を 含む試料溶液を 1 % B SAを含 む緩衝液 A で希釈 し 、 各試験管に 300 μ ώを加え た。 次に 前記（ a )項で調製 し た抗体結合ボ ー ル を 加え、 37。Cで 1 時間振 と う 加温後（第 1 反応） 、 0.1M塩化ナ ト リ ウ ム 含 有 10mMリ ン 酸緩衝液（PH7.0) 3 で各試験管 を 3 回洗浄 し た。 次に実施例 2 ( a)項で調製 した Fab ' - POD複合体を 20ngZ試験管と な る よ う に 0. 1 % BSA及び 0. 1 M塩化ナ ト リ ウ ム 含有 10mMリ ン酸緩衝液（PH7.0) で希釈 し 30°C で 1 時間振 と う 加温 し た （第 2 反応） 。 反応終了後、 第 1 反 応終了時 と 同様に 洗浄 し た 。 次 に 0 . 1 M酢酸緩衝液 （ pH 5.5) に溶解 し た POD基質、 す な わ ち 0.0134% テ ト ラ メ チ ル ベ ン チ ジ ン （TMBZ) を 0.3mi2加え 、 更に 0.01%過酸化水 素 O. lrafiを 加え て 30°Cで 1 時間振 と う 加温（第 3 反応） 後、 1 .33 N硫酸 0.6mJ2を添加す る こ と に よ り 反応を停止 さ せ た 。 そ の反応混液の A4 5。値 を 分光光度計で測定 し 、 標準 直線 よ り'試料 中 の コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー 量 を 求 め た 。
    [0063] (c) サ ン ド イ ッ チ測定用 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の選択
    [0064] コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー を 定量す る こ と が可能な モ ノ ク 口 ー ナ ル抗体の組み合わ せ を探す 目 的で実施例 1 (i) 項の方法で精製 し た ク ロ ー ン 7— 3F1、 7— 6C1、 7— 19F6、 お よ び 7— 21B12の各モ ノ ク 口 一 ナ ル抗体か ら Fab'- POD複 合体を調製 した。 一方、 ク ロ ー ン 7— 3F 1、 7 — 4F2、 7 - 5A1、 7 - 6C1、 7 - 7F1 l 7— 8B2、 7 - 9B4、 7— 10E11、 7 一 1U5、 7 - 12B6、 7 - 15E8、7 - 18F3、 7 - 19F6、 7 - 20C2、 7— 21B12、 お よ び 7— 23G9 の各モ ノ ク ロ ー ナル抗体を 固 相 と して、 試験管当た り I nsの精製 し た ゥ シ齒髄コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を用 い て実施例 3 ( b )項の方法に よ り サ ン ド イ ッ チ定量を行 っ た。 得 ら れた A4 5。値を後掲の 第 2 表に示す。 な お、 第 2 表中の A4 5。値は試料 l ng添加 の値力 ら コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー を添加 し な い時の値 を差 し引 い た数値であ る 。 上記 4 種類の いずれの Fab ' - P0D複合.体を 用 いた場合に おい て も 、 固相 と し て 7— 4F2、 7- 11A5、 7 - 12B6、 7 - 18F3、 7- 20C2、 お よ び 7 - 23G9 の 6 種類の抗体を用 い た時の A4 5。が 2 以上の値を示 し た。 次に こ れ ら 24通 り の組み合わ せ につ いて、 ゥ シ歯髄コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー の添加量を変えてサ ン ド ィ ツ チ定 量を 行 っ た。 Fal)' (ク ロ ー ン 7— 6C1) — PODを複合体 と し て、 ク ロ ー ン 7 — 23 G9抗体を 固相 と し た場合に得 られた 結杲を第 2 図 に示す。 第 2 図 に示す よ う に、 添加 し た ゥ シ齒髄コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量 と 5。の間に直線関 係が成立 し、 定量感度は試験管当た り 約 i pg(32 a πιοώ) であ っ た。 上記以外の組み合わ せにつ いて も 上記の直線 関係がみ ら れ、 い ずれの組み合わせ につ い て も サ ン ド ィ ツ チ定量が可能であ る こ と がわか っ た 。
    [0065] 実施例 4
    [0066] ヒ ト 血清中 の コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一 の 同定
    [0067] (a) ァ フ ィ 二 テ ィ カ ラ ム の調製
    [0068] Nature 214, 1302〜 1304 ( 1967 )に記載の Axenら お よ び
    [0069] Proc . Nat l - Acad. Sc i . USA , 6^ 636- 643 (1968) に記 載の C ua t r e c as a s ら の方法に従つ て臭化 シァ ン を介 して 担体の セ フ ァ ロ ー ス 4 B に リ ガ ン ド と し て実施例 l ( i ) 項で得 ら れた精製モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を 固定化 し た 。 次 に 抗体結合セ フ ァ ロ ー ス 4 B ゲル 0 . 3 m £を ガ ラ ス管に充 填 し 、 0 . 1 M塩化ナ ト リ ゥ ム お よ び 5 m M塩化 カ ル シ ウ ム 含有 30mMト リ ス — 塩酸緩衝液（PH8.0) で平衡化 し使用 し た 。
    [0070] (b) ヒ 卜 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の ァ フ ィ 二 テ ィ カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー
    [0071] ヒ ト 血清 l ra j2を 0 . 1 M塩ィ匕ナ ト リ ゥ ム お よ び 5 m M塩化 カ ル シ ウ ム 含有 30mM 卜 リ ス — 塩酸緩衝液（PH8.0) に対 し て透析 し た後、 上記（ a )項記載の方法に 従 っ て調製 し た ク ロ ー ン 7— 21B12抗体結合セ フ ァ ロ ー ス 4 B カ ラ ム に供 し 、 上記緩衝液で洗浄 し （非吸着画分）、 次 に カ ラ ム を 2 M塩化ナ ト リ ゥ ム含有 30mM ト リ ス — 塩酸緩衝液（PH7.5) お よ び 0.5 M塩化ナ ト リ ゥ ム 含有 0.2 M グ リ シ ン — 水酸化 ナ ト リ ゥ ム 緩衝液（PH 10.5)で順次洗浄 し （洗浄画分）、 最 後 に カ ラ ム に 吸着 し た蛋 白質 を 0 . 2 M グ リ シ ン — 塩酸緩 衝液（PH2.0)で溶出 し た （溶出画分） 。 得 ら れ た溶 出画分 を 0 . 1 M塩化ナ ト リ ゥ ム お よ び 5 m M塩化カ ル シ ウ ム含有 30mMト リ ス ー 塩酸緩衝液（PH8.0) 中で透析 し た後、 も う 一度 ク ロ ー ン 7— 21B12抗体結合セ フ ァ ロ ー ス 4 B カ ラ ム を 用 い た再ァ フ ィ 二 テ ィ ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に供 し、 上 記 と 同様の操作に よ り 溶出画分に コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を得た。 そ こ で、 ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一 に対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体力 ヒ ト 血清コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー と 交叉する のか否かを検討す る ため、 上記 の溶出画分 を SDS-PAGEに供 した後、 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ を行 っ た。 第 3 図は ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ後 の ニ ト ロ セ ル ロ ー ス膜を 1 : ク ロ ー ン 7 - 3F1、 2 : ク ロ ー ン 7— 6C1、 3 ： 7 - 19F6、 4 ： ク ロ ー ン 7— 21B 12お よ び 5 ： ク ロ ー ン 7 - 23G9の各モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体か ら賙製 した Fa - POD複合体で免疫染色を行 っ た結果を示す も の であ る 。 第 3 図 に示さ れ る よ う に、 ヒ ト 血清中 に も ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー に対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 ど反応す る コ ラ ゲナ 一ゼ ィ ン ヒ ビ タ ーが存在す る こ と が わか っ た。 し かも 、 それ ら の分子量は いずれ も 実施例 1 ( a )項で得 ら れた ゥ シ歯髓 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビタ 一 の それ と 同 じ 32 , 000 D であ る こ と がわ力 つ た。
    [0072] 実施例 5
    [0073] サ ン ド イ ッ チ測定法に よ る ヒ ト 血清中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の定量
    [0074] (a) 標準直線の作成
    [0075] ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビタ ー を サ ン ド イ ッ チ定量す る の に最 も 適 し た モ ノ ク ロ ー ナル抗体の組み合わせ に つ い て検討 し た。 実施例 3 ( c )項に示 し た よ う に 、 ゥ シ歯 髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を 感度良 く 定量で き る 4 種 類の Fab ' -POD複合体、 すなわち、 Fab ' (7— 3F1 )-P0D、 Fab'(7- 6C1)- P0D、 Fab' (7 - 19F6)- PODお よ び Fab' (7- 21 Bl 2) -PODと 6 種類の固相用抗体、 す な わ ち 、 ク ロ ー ン 7 - 4F2、 7 - 11A5、 7 - 12B6、 7 - 18F3、 7 - 20C2および 7— 23G 9の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を用 いた 24通 り の組み合 わ せ の う ち 、 実施例 4 ( b )項 に 記載 し た と お り に カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー処理 し た ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー を 定量で き る 組み合わ せ を 調べた。 そ の結果、 ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を抗原 と し た場合、 用 い た ほ と ん どの組み合わ せで A 4 5。の シ グナ ル は全 く 検 出 さ れ な か っ たが、 固相用抗体 と し て ク ロ ー ン 7-23G9抗 体、 複合体 と し て Fab' (ク ロ ー ン 7- 6C1)— PODを 用 い た場 合、 サ ン ド イ ッ チ定量可能であ る こ と がわ力 つ た 。 次 に 、 上記の組み合わせ を 用 い て、 実施例 3 ( c )項に示 し た方 法に よ り 、 ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の添加量 を変え てサ ン ド ィ ツ チ定量 を 行 う こ と に よ っ て標準直線 を 作成 し、 得 ら れた結果 を 第 4 図 に示す。 第 4 図 に み ら れ る よ う に 、 添加 し た ヒ 卜 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一量 と A45。の間 に 直線関係が成立 し 、 ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の定量が可能であ る こ と がわ 力 つ た 。 し 力、 し 、 そ の定量感度は試験管当 た り 約 10pg(320 a raofi) で あ り 、 ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の場合の定量 感度〔試験管当た り 1 P。に比べて 10倍低い こ と がわか つ た 。
    [0076] (b) 息者血清中の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の定量
    [0077] 上記（ a )に おいて示 し たモ ノ ク ロ ーナル抗体の組み合 わせ を用 い て健常人血清 95検体、 屎癸性肝臓癌息者血清 100検体およ び転移性肝臓癌患者血清 3 検体の 中に存在 す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を サ ン ド ィ ツ チ定量 し、 そ の結果を そ れぞれ第 3 表の 1 、 2 お よ び 3 に示 した。 な お、 こ のサ ン ド.イ ッ チ定量に お いて、 標準直線の作成 に は抗原 と して実施例 4 (b)項で精製 し た ヒ ト 血清コ ラ ゲナ 一 ゼ イ ン ヒ ビタ ー を用 いた。 ま た、 こ の定量は検体 血清を 1 % BSAを含む緩衝液 Aで 1 , 600倍に希釈 して行 つ た。 第 3 表の 1 お よ び 2 に示 し た数値は同一の実験系 を 2 回行 っ た結杲の平均値であ る 。 第 3 表の 1 にみ ら れ る よ う に、 健常人血清 l mi2中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一量は平均 1.59土 0.37 であ る の に 対 し 、 原発 性肝臓癌患者血清お よ び転移性肝臓癌患者血清 1 中 に 存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量は第 3 表の 2 お よ び 3 に見 ら れ る よ う に それぞれ平均 3.22± 2.10 i2お よ び 7.81± 3-87；^と 高い値を示 し た。 一方、 肝硬変患者血清 46検体、 慢性活動性肝炎息者血清 45検体お よ び慢性非活 動性肝炎息者血清 26検体の 中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビタ ー を サ ン ド ィ ツ チ定量 し た値を それぞれ、 第 4 表の 1 、 2 お よ び 3 に示 し た。 そ の結杲、 肝硬変息者血 清中、 慢性活動性肝炎患者血清中お よ び慢性非活動性肝 炎患者血清中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量は それぞれ平均 1.52土 1.08/^、 1.55士 0.58 お よ び 1.10土 0.48^であ り 、 こ れ ら の値は い ずれ も 健常人血清中 に存 在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量 と 有意の差は認め ら れな 力 つ た 。
    [0078] 実施例 6
    [0079] ヒ 卜 血清中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の精製
    [0080] 実施例 4 の （b )で最終的 に 得 ら れた溶出画分中 に は前 述 し た と お り 、 ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 と 反応す る コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ーが存在す る （第 3 図参照） 。 し カゝ し 、 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー以外 に も 、 上記モ ノ ク ロ ー ナル抗体 と は 反応 し な い蛋 白質が多種存在す る こ と が認め ら れた。 そ こ で 、 こ の溶出画分 を 0.1M リ ン酸緩衝液（PH7.5)で平衡 ィ匕 し た AcA 44カ ラ ム を 用 レ、 てゲノレ ^過 を 行い、 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー と 他の蛋 白質 と を 分離す る こ と に よ り ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー を 精製 し た 。 第 5 図 は得 ら れ た血清 コ ラ ゲナ 一 ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー （ 1 )、 対照 と し て の ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一 （ 2 ) お よ び分 子量マ ー カ 一 （3)の各 SDS-PAGEパ タ 一 ン を 示 し て い る 。 第 5 図 に み ら れ る よ う に、 ヒ 卜 血淸 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の分子量は ゥ シ歯髓 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の そ れ と 同様、 32, 000 D であ る こ と がわ 力 つ た 。
    [0081] 実施例 7
    [0082] サ ン ド イ ッ チ測定法 に お け る 精製 ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ 一 ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の標準直線の作成
    [0083] 実施例 6 に おいて得 ら れた精製 ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビ タ 一の添加量を変え て、 実施例 5 の（ a)項記載 の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の組み合わ せ を 用 い てサ ン ド ィ ッ チ定量を行 う こ と に よ っ て標準直線を作成 した。 得 ら れ た結果は第 6 図 に示す と お り であ る 。 第 6 図に み ら れる よ う に、 添加 し た ヒ ト 血清コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビタ ー量 と Α45。の間に直線関係が成立 し、 こ の時の定量感度は試 験管当 た り 1.5p (48 a πιοβ)であ っ た。 こ の定量感度は、 実施例 5 の （a)項で作成 し た標準直線の場合に比べて 6.7 倍高 く 、 ま た、 実施例 3 の（ c )項記載の ゥ シ歯髄 コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の場合に比べて 1 . 5倍低い こ と がわ か つ す： 。
    [0084] 実施例 8
    [0085] サ ン ド ィ ツ チ測定法に よ る ヒ ト 血清中 あ る い は ヒ ト 血清 中の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の定量に基づ く 肝臓癌疾 息の診断
    [0086] (a) 肝疾患息者血清中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビタ 一の定 実施例 7 に お い て示 し たモ ノ ク ロ ー ナル抗体の組み合 わ せ を用 い て健常人血清 50検体、 原癸性肝臓癌息者血清 100検体お よ び転移性肝臓癌患者血清 3 検体の中 に存在 す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を サ ン ド ィ ツ チ定量 し、 そ の結杲を そ れぞれ、 第 5 表の 1 、 2 お よ び 3 に示 し た な お、 こ の サ ン ド イ ッ チ定量に おい て、 標準直線の作成 に は抗原 と し て実施例 6 で精製 し た ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー を 用 い た 。 ま た、 こ の定量 は検体血清 を 1 % BSAを含む緩衝液 A で 1 , 600倍に希釈 し て行っ た。 第 5 表の 1 、 2 お よ び 3 に示 し た数値は同一の実験糸 を 2 回行 っ た結果の平均値であ る 。 第 5 表の 1 に み ら れ る よ う に 、 健常人血清 Ι τηβ中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一量は平均 184 ± 31 であ る の に対 し 、 原発性肝 臓癌患者血清お よ び転移性肝臓癌患者血清 1 m2中 に 存在 す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一量は第 5 表の 2 お よ び 3 に 見 ら れ る よ う に それぞれ平均 484 ± 316ngお よ び 1171土 712ngと 高い値 を示 し た。 一方、 肝硬変患者血清 46検体、 慢性活動性肝炎患者血清 45検体お よ び慢性非活動性肝炎 患者血清 26検体の 中に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一を サ ン ド イ ッ チ定量 し た値を そ れぞれ、 第 6 表の 1 、 2 お よ び 3 に示 し た 。 第 6 表 に 見 ら れ る よ う に 、 肝硬変 患者血清中、 慢性活動性肝炎患者血清中 お よ び慢性非活 動性肝炎患者血清中に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一量 は それぞれ平均 228土 163ng、 233± 88n お よ び 166土 73ngであ り 、 こ れ ら の値 は い ずれ も 健常人血清中 に存在 す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量 と 有意の差 は認め ら れ な カゝ つ た 。
    [0087] (b) 肝疾患患者血漿中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の定
    [0088] Br . J . Haematol . 31, 239 - 247C 1976)に 記載の Lud 1 am と Cashの方法 に従 っ て、 健常人血液お よ び原発性肝臓癌 疾患恩者血液か ら それぞれの血漿を採取 し た。 な お、 こ こ で採取 し た血漿は、 血液に EDT i プ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン E 、 お よ びテ オ フ ィ リ ン を 加え冷却 し た後、 4 °C で 1900 X g 60分間遠心分離 し て得 ら れた上澄であ り 、 血液中の 血小板は、 分解 さ れずに沈殿画分に と どま つ て い る 。
    [0089] 上記の如 く し て得 ら れた健常人血漿 26検体お よ び原発 性肝臓癌患者血漿 8 検体の 中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を上記（ a )項に示 し た の と 同 じ方法を用 いて サ ン ド ィ ツ チ定量 し た。 そ の結果は後掲の第 7 表に示 さ れ る と お り であ る 。 第 7 表にみ ら れ る よ う に、 健常人血 漿 i mfi中 に存在す る コ ラ ゲナ 一 ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量は平均 64 ± l ongであ る の に対 し、 原発性肝臓癌疾患患者血槳中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量は平均 583 ± 447 n と 高い値を示 し た。
    [0090] C c ) モ ノ ク ロ ー ナル抗体 と コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー と の特異的反応の確認
    [0091] 実施例 4 、 C b )項に示 し た よ う に、 サ ン ド イ ッ チ測定 法に用 い る 2 種類の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体（ク ロ ー ン 7 - 6 C 1 と ク ロ ー ン 7— 23G9 ) は ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビタ ー と 反応す る が、 血清あ る い は血漿な どの よ う に、 種々 の蛋 白質が高濃度で溶解 し てい る 系でも 、 こ の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体がコ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー と 特異的 に反応 し て い る こ と を確認す る た め の試験 を行 っ た。
    [0092] 健常人血清あ る い は肝臓癌患者血清を 0 . 1 M塩化ナ ト リ ゥ ム お よ び 5 mM塩ィ匕カ ル シ ウ ム含有 30 mM卜 リ ス ー塩酸 緩衝液 （ PH8.0) で 5 倍に希釈 し た後、 実施例 4 の （a)項 記載の方法に従 っ て調製 し た ク ロ ー ン 7-23G9 ( サ ン ド ィ ツ チ測定法の固相用抗体） 結合セ フ ァ ロ ー ス 4Bカ ラ ム に 供 し 、 実施例 4 の （ b )項記載の方法に 従 っ て溶出画分 を 得た。 こ の溶出画分 を SDS- PAGEに供 し た後、 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ を 行 レ、 、 サ ン ド イ ッ チ 測定法の標識抗体 で あ る Fab' (ク ロ ー ン 7— 6C1)— POD複合体で免疫染色 を 行 つ た。 そ の結果 は第 7 図 に示す と お り であ る 。 1 ： 精製 ヒ ト 血清 コ ラ ゲ ナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一 、 2 ： 健常人血清、 3 ： 肝臓癌患者血清の い ずれ を用 い た場合 に も 、 単一バ ン ド を 示す こ と か ら 、 本発明 の診断法に お け る サ ン ド ィ ツ チ測定法では、 極め て特異的 に コ ラ ゲ ナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一だ けが定量 さ れて い る こ と が示 さ れた 。
    [0093] 以上述べた こ と カゝ ら 明 ら かな よ う に 、 本発明方法を 用 い る こ と に よ り 、 肝臓癌疾患の診断 を 、 簡便に 、 短時間 内 に さ ら に感度良 く 行 う こ と がで き る 。
    [0094] X
    [0095]
    [0096] 2
    [0097]
    [0098] 第 3 表 の 1
    [0099] 第 3 表 の 2 原 性 肝 臓 癌 患 者 血 清 コラゲ + コラゲナ コラゲナ コラゲ十 検体 ーゼィン 侠体 —セ ン 検体 ーゼィン 検体 ーゼイ ン 口
    [0100] ヒビタ一 せ 食^" グ一 ヒビター
    [0101] OlgZ O,ヽ (ttg / 0,~)
    [0102] 八
    [0103] 1 3.38 26 7-08 51 1.53 76 2.32
    [0104] 2 2.28 27 1-00 52 4.17 77 1.58
    [0105] no
    [0106] 3 2-35 28 4.00 bo 2.83 7o 5.27
    [0107] 4 4.25 29 54 2. id 79 2.44 no
    [0108] 5 4.32 30 00 4.87 2.13
    [0109] 6 4.10 31 91 bo 5.27 ol 1.65 oo
    [0110] 7 1.34 32 D( 7.08 O 2.91
    [0111] no oo
    [0112] 8 4.32 33 00 O.DD 00 2.91
    [0113] <7 c
    [0114] 9 0.94 34 4* θ c
    [0115] / by 4. 0
    [0116] DO 6.76 m
    [0117] 10 7.39 35 DU gi 00 0.82
    [0118] 11 3.07 36 0 A A di 4.1/ oD 2.32
    [0119] o 07
    [0120] 12 3.67 37 丄 DZ 丄 0/ 1.85
    [0121] 0
    [0122] 13 13.77 38 0.00 o 00
    [0123] 00 2.99
    [0124] 14 3.61 39 ο· /U o4 on
    [0125] 0.00 2.24
    [0126] 15 4.32 40 1 18 u 9 · 01 on 2.91
    [0127] 16 4.17 41 2.99 66 3.38 91 2.49
    [0128] 17 2.04 42 4.56 67 4.63 92 2.09
    [0129] 18 1.37 43 1.65 68 1.46 93 1.53
    [0130] 19 1.46 44 1.70 69 1.89 94 2.16
    [0131] 20 1.53 45 1.65 70 4.10 95 3.46
    [0132] 21 5.59 46 1.22 71 1.46 96 1.10
    [0133] 22 1.89 47 1.80 72 2.98 97 1.97
    [0134] 23 1.80 48 1.34 73 2.99 98 1.46
    [0135] 24 2.28 49 1.34 74 1.37 99 3.86
    [0136] 25 2.16 50 1.37 75 1.65 100 3.22 平 均 3.22±2·10 /nH 第 3表の 3 転移性肝臓癌患者血清 検体 コラゲナーゼ 番号 イ ンヒ ビター
    [0137] 1 13.01 2 6.69 3 3.72
    [0138] 平均 7.81± 3.87 /md 第 4 表 の 1 肝 硬 変 患 者 血 清 検体 コラゲナ一ゼ 検体 コラゲナーゼ
    [0139] c
    [0140] 番 ィ ノ ヒ ヒ グ ー 杳 a
    [0141] ィ ノ ヒ ヒ タ ー
    [0142] { H O )
    [0143] 1 1.22 26 0.82
    [0144] 2 0.75 27 1.85
    [0145] 3 0.77 28 2.00
    [0146] 4 1.14 29 2.12
    [0147] 5 1.22 30 0.67
    [0148] 6 1.37 31 1.42
    [0149] 7 1.03 32 0.80
    [0150] 8 1.77 33 1.03
    [0151] 9 1.58 34 1.70
    [0152] 10 1.65 35 0.64
    [0153] 11 1.70 36 0.94
    [0154] 12 2.13 37 2.12
    [0155] 13 1.06 38 0.57 丄4 π u . o ona b U - 4
    [0156] 15 2.32 40 1.49
    [0157] 16 2.44 41 1.80
    [0158] 17 2.12 42 0.79
    [0159] 18 1.42 43 1.42
    [0160] 19 1.53 44 0.66
    [0161] 20 1.70 45 1.49
    [0162] 21 2.52 46 1.49
    [0163] 22 0.25
    [0164] 23 7.63
    [0165] 24 1.22
    [0166] 25 2.11
    [0167] 平均 1.52±1.07 119/nQ. 第 4 表の 2
    [0168] 慢性活動性肝炎患者血清 検体 コラゲナ一ゼ 餘佐 コ -^ノ7 ノ -ソ一― ィ ン ヒ ビタ一 イ ン ヒ ビター
    [0169] V-^/ nil)
    [0170] 1 1.42 26 し 92
    [0171] 2 2.59 27 0.86
    [0172] 3 1.41 28 2.91
    [0173] 4 3.38 29 1.37
    [0174] 5 1.37 30 1.15
    [0175] 6 1.03 31 1.30
    [0176] 7 1.77 32 2.24
    [0177] 8 1.61 33 1*10
    [0178] 9 1.42 34 0.76
    [0179] 10 1.89 35 0.72 ，
    [0180] 11 1.85 36 0.72
    [0181] 12 1.80 37 1.97
    [0182] 13 1.65 38 0.91
    [0183] 14 1-22 39 1.06
    [0184] 1 it) 丄 - 40 1.97
    [0185] 16 0.97 41 0.91
    [0186] 17 0.76 42 1.77
    [0187] 18 2.04 43 0.91
    [0188] 19 2.09 44 し 85
    [0189] 20 2.16 45 0-91
    [0190] 21 1.89
    [0191] 22 1.65
    [0192] 23 1.25
    [0193] 24 1.77
    [0194] 25 1.65
    [0195] 平均 1.55±0. 58 viQ. 第 4 表 の 3 慢性非活動性肝炎患者血清
    [0196] J . ir コラゲナーゼ 横体 J フ ケナーセ イ ン z 匕 ビ夕 ー ¾：-& イ ン ヒ ビタノ ー
    [0197] Ogf
    [0198] 1 1 ·5ο ΔΌ 0.97 o ΟΛ
    [0199] 丄 - il
    [0200] 0 丄 ·丄
    [0201] A
    [0202] 4
    [0203] r Λ Q7
    [0204] 0
    [0205] D 1 Q7
    [0206] 7 π 70
    [0207] Q
    [0208] O 丄 ·34
    [0209] π 1 A
    [0210] y
    [0211] 1U 丄 * lb
    [0212] 11
    [0213] o CO
    [0214] L
    [0215] 13 1 · lo
    [0216] 14 1. lb
    [0217] 丄 丄 · 丄 o
    [0218] 16 1.46
    [0219] 17 0.49
    [0220] 18 0.54
    [0221] 19 0.30
    [0222] 20 1.15
    [0223] 21 0.79
    [0224] 22 0.52
    [0225] 23 0.63
    [0226] 24 0.98
    [0227] 25 0.91
    [0228] 平均 1.10±0.48 第 5 表 の 1 人 ΠΤϊ
    [0229] 1111
    [0230] 検体 コラゲナーゼ 検体 コラゲナーゼ
    [0231] Λ ノ ヒ ヒ グ ー 番 イ ン ヒ ビター π mii
    [0232] 1 123 26 155
    [0233] 2 131 27 225
    [0234] 3 210 28 185
    [0235] 4 161 29 245
    [0236] 5 176 30· 200
    [0237] 6 210 31 210
    [0238] 7 200 32 210
    [0239] 8 191 33 176
    [0240] 9 155 34 165
    [0241] 10 210 35 176
    [0242] 11 155 36 176
    [0243] 12 200 37 185
    [0244] 13 170 38 245
    [0245] 14 210 39 155
    [0246] 15 123 40 210
    [0247] 1 ft 1
    [0248] 丄 0 丄 on
    [0249] 41 155
    [0250] 17 155 42 200
    [0251] 18 161 43 236
    [0252] 19 176 44 230
    [0253] 20 200 45 191 '
    [0254] 21 221 46 165
    [0255] 22 200 47 176
    [0256] 23 170 48 210
    [0257] 24 221 49 165
    [0258] 25 150 50 155 平 均 184士 31 第 5 表 の 2 原 発 性 肝 臓 癌 患 者 血 ΐη
    [0259] コラゲナ フケナ コラゲナ コラゲナ 検体 —ゼイ ン 検体 ^ィ ーゼイ ン 検体 ーゼィン 番号 ヒビター 番号 ヒビター 番号 ヒビター ヒビタ一
    [0260] 1 507 26 1 0R9 1 230 76 348
    [0261] 2 342 27 9Q7 RO 626 77 237
    [0262] 3 353 28 uou C J:OQ 425 78 791
    [0263] 4 638 29 j¾ 320 79 366
    [0264] 5 648 30 O I 731 80 320
    [0265] 6 615 31 ou 791 81 248
    [0266] 7 201 32 丄 1 7 ί丄1 Π 1 1062 82 437
    [0267] 8 648 33 1299 83 437
    [0268] 9 141 34 708 698 84 1014
    [0269] 10 1109 35 336 437 85 123
    [0270] 11 461 36 366 61 626 86 348
    [0271] 12 551 37 7R 237 87 278
    [0272] 13 2066 38 リ 672 88 449
    [0273] 14 542 39 o R4 875 89 336
    [0274] 15 648 40 111 65 437 90 437
    [0275] 16 626 41 449 66 . 507 91 374
    [0276] 17 306 42 684 67 694 92 314 丄 1 0Q 43 248 68 厶 9丄1 Q 3
    [0277] 19 219 44 255 ' 69 284 94 324
    [0278] 20 230 45 248 70 615 95 519
    [0279] 21 839 46 183 71 219 96 165
    [0280] 22 284 47 270 72 447 97 296
    [0281] 23 270 48 201 73 449 98 219
    [0282] 24 342 49 201 74 206 99 579
    [0283] 25 324 50 206 75 248 100 483 平 均 484 ± 316 第 5表の 3 転移性肝臓癌患者血清 検体 コラゲナーゼ 番号 イ ン ヒ ビター
    [0284] 1 1952 2 1004 3 558
    [0285] 平均 1171±712 第 6表の 1
    [0286] 第 6表の 2 慢性活動性肝炎息者血清 検体 コラゲナーゼ 検体 コ ラゲナーゼ
    [0287] ¾ イ ン ヒ ビタ ー ¾ イ ン ヒ ビタ ー
    [0288] 1 213 26 288
    [0289] 2 389 27 129
    [0290] 3 212 28 437
    [0291] 4 507 29 206
    [0292] 5 206 30 173
    [0293] 6 155 31 195
    [0294] 7 266 32 336
    [0295] 8 242 33 165
    [0296] 9 213 34 114
    [0297] 10 284 35 108
    [0298] 11 278 36 108
    [0299] 12 . 270 37 296
    [0300] 13 248 38 137
    [0301] 14 183 39 159
    [0302] 15 278 40 296 丄 D A T
    [0303] 1 0 4丄 丄0 /
    [0304] 17 114 42 266
    [0305] 18 306 43 137
    [0306] 19 314 44 278
    [0307] 20 324 45 137
    [0308] 21 284
    [0309] 22 248
    [0310] 23 188
    [0311] 24 266
    [0312] 25 248
    [0313] 平 均 233 ± 88 第 6表の 3 慢性非活動性肝炎患者班清 快 W ノ ア -ァί- J LT 恢 コ フ ケナ tr 番号 イ ンヒ ビター ¾:号 イ ン '々 一
    [0314] 1
    [0315] 丄 Δό ί ώ!3 1 t) o 丄 yiD
    [0316] ό q 丄 03
    [0317] Ai 丄
    [0318] 1 0
    [0319] u onfi
    [0320] 7 丄 uo
    [0321]
    [0322] Q ^flii丄l
    [0323] 丄 u 丄 1 71 Q
    [0324] 丄 1 丄 1 079
    [0325] 丄 1 o乙
    [0326] 丄》J 1 77
    [0327] 丄 1 4 ¾ 丄 / ϋ
    [0328] 15 177
    [0329] 16 219
    [0330] 17 74
    [0331] 18 81
    [0332] 19 45
    [0333] 20 173
    [0334] 21 119
    [0335] 22 78
    [0336] 23 95
    [0337] 24 147
    [0338] 25 137
    [0339] 平 均 166 土 73 第 7 表 is* 2* R gat
    [0340] 吊 入 皿 乘 検体 コラゲナーゼ 検体 コラゲナーゼ
    [0341] ¾ イ ン ヒ ビター 番号 イ ン ヒ ビター n^/ il J π / mil )
    [0342] 1 61 1 175
    [0343] 2 78 2 431
    [0344] 3 44 3 1534
    [0345] 4 70 4 943
    [0346] 5 75 ' 5 261
    [0347] 6 84 6 429
    [0348] 7 70 7 366
    [0349] 8 54 8 523
    [0350] 9 49
    [0351] 10 74
    [0352] 11 73
    [0353] 12 64
    [0354] 13 72
    [0355] 14 62
    [0356] 15 67
    [0357] 16 54
    [0358] 17 74
    [0359] 18 51
    [0360] 19 57
    [0361] 20 53
    [0362] 21 60
    [0363] 22 60
    [0364] 23 64
    [0365] 24 56
    [0366] 25 62
    [0367] 26 74
    [0368] 平 均 64±10 平 均 583 ±447 〔図面の簡単な説明〕
    [0369] 第 1 図 は ゥ シ歯髄 コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を S D S - PAGEに 供 し た後、 種 々 の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を 用 い た時 の ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グノく タ ー ン を示す 図 であ り 、 第 2 図は固相 7— 23G9抗体一複合体 Fab ' ( 7— 6C 1 )— POD測 定系での ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の標準直線 を示す図 であ り 、 第 3 図 は ヒ 卜 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー を SDS-PAGEに 供 し た後、 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ を行 っ た時の免疫染色のパ タ ー ン を 示す図 であ り 、 第 4 図は固相 7 - 23G9抗体一複合体 Fab ' (7 - 6C 1 ) -P0D測定 系での ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の標準直線 を 示す 図 であ り 、 第 5 図 は ヒ ト 血清か ら 精製 し た コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の SDS- PAGEノ、。 タ ー ン を 示す図 であ り 、 第 6 図 は精製 し た ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一 を 用 い て、 サ ン ド ィ ツ チ測定 し た時の標準直線 を 示す 図で あ り 、 第 7 図 は ヒ 卜 血清 を I gG(7— 23G9)抗体結合ァ フ ィ 二 テ ィ カ ラ ム に供 し て得 ら れた溶出画分を SDS- PAGEに 供 し た後、 Fab' (7— 6C1)-P0D複合体 を 用 い た時の ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ ノ タ ー ン を 示す図 であ る 。
    权利要求:
    Claims

    求 の 範 囲
    コ ラ ゲナ ー ゼィ ン ヒ ビタ ーの異な る 抗原決定基に対 し 特異的 に結合す る 2 種類のモ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の組み合 わせを用 いたサ ン ド ィ ツ チ法に よ り 、 酵素免疫学的に血 清中、 血漿中 あ る い は関節液中 に存在す る コ ラ ゲナ ーゼ イ ン ヒ ビ タ ー を定量 し、 そ の定量値を健常人の値 と 比較 する こ と を特徵 と す る 肝臓癌疾患の診断法。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    US5175084A|1992-12-29|
    DE3850962T2|1994-12-22|
    DE3850962D1|1994-09-08|
    EP0339097B1|1994-08-03|
    KR920002182B1|1992-03-19|
    EP0339097A4|1990-12-05|
    KR890702037A|1989-12-22|
    EP0339097A1|1989-11-02|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1989-05-05| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): KR US |
    1989-05-05| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): DE FR GB IT |
    1989-06-29| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1988909389 Country of ref document: EP |
    1989-11-02| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1988909389 Country of ref document: EP |
    1994-08-03| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1988909389 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP27326587||1987-10-30||
    JP62/273265||1987-10-30||EP88909389A| EP0339097B1|1987-10-30|1988-10-28|Method for diagnosis of liver cancer|
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